1、單分子DNA從納米孔通過；

　　2、納米孔上的酶對于測序分子在單核苷酸精度的控制；

　　3、單核苷酸的測序精度控制。目前市場上廣泛接受的納米孔測序平臺是Oxford Nanopore Technologies（ONT）公司的MinION納米孔測序儀。它的特點是單分子測序，測序讀長長（超過150kb），測序速度快，測序數據實時監控，機器方便攜帶等。這篇綜述重點總結了MinION測序儀的技術特點和應用領域。

　　一、 MinION測序技術簡介MinION納米孔測序儀的核心是一個有2，048個納米孔，分成512組，由專用集成電路控制的flow cell。測序原理見圖1a所示：首先，將雙分子DNA連接lead adaptor（藍色），hairpin adaptor（紅色）和trailing adaptor（棕色）；測序開始，lead adaptor帶領測序分子進入由酶控制的納米孔，lead adaptor后是template read（即待測序的DNA分子）通過納米孔，hairpin adaptor的作用是DNA雙鏈測序的保證，然后complement read（待測序分子的互補鏈）通過納米孔，最后是trailing adaptor通過。

　　在上述測序方法中，template read和complement read依次通過納米孔，利用pairwise alignment，它們組合成2D read；而在另外一種測序方法中，不使用hairpin adaptor，只測序template read，最終形成1D read。后一種測序方法通量更高，但是測序準確性低于2D read。每個接頭序列（adaptor）通過納米孔引起的電流變化不同（圖1c），這種差別可以用來做堿基識別。

 

　　二、 MinION相對于其他NGS測序平臺的優勢

　　1、堿基修飾的檢測納米孔測序技術可以檢測四種胞嘧啶（cytosine）堿基修飾，分別為5－methycytosine，5－hydroxymethycytosine，5－formylcytosine和5－carboxylcytosine。檢測準確率為92％－98％。

　　2、實時測序監控對于臨床實踐，實時獲取和分析DNA／RNA序列是一件很重要的事情。對于傳統的NGS測序，做到這一點非常不易。但對于MinION，實現起來相對容易。這不僅是因為MinION體積小，易操作等，更是因為在測序過程中單分子穿過納米孔，其電流變化可以檢測并識別，這種設計允許用戶在測序過程中根據實時結果做出一些判斷。實時測序監控對于MinION針對特定目標序列測序有重要的應用（圖2）：當DNA片段通過納米孔時，如果電流變化呈現與目標序列一樣的趨勢，則通過納米孔。如果DNA片段與目標序列呈現不同的電流變化趨勢，則不能通過納米孔。通過這樣的方式，實現目標序列的富集，從而顯著減少測序時間，對于在野外和即時診療有重要意義。

　　3、測得更長的read用MinION測序儀，對于1D read可以獲得300kb長的read；對于2D read可以獲得60kb長的read。利用MinION測序儀產生的長read，研究人員設法填充了人參考基因組Xq24號染色體一個長50kb的gap。該區域存在多個CT47基因串聯拷貝，研究人員利用MinION的長read判斷該區域極有可能存在8個CT47基因拷貝。

　　4、結構變異的檢測NGS短序列的特征使結構變異的檢測往往不準確。這個問題在癌癥的檢測中尤其嚴重，這是因為癌癥組織中充斥各種結構變異。研究人員發現利用MinION測得的幾百個拷貝的長read得到的結構變異結果比NGS平臺測得的上百萬read得到的結果更可靠。

　　5、RNA表達分析對于RNA表達分析，NGS平臺測得的短序列帶來的問題是序列需要進行拼接，才能得到轉錄本。這給可變剪切研究帶來困擾。因為通常情況下NGS測序不能產生足夠的信息將不同形式的可變剪切區分開來。而利用MinION測序儀產生的長read，可以更好地解決這個問題。研究人員利用果蠅的Dscam1基因為例，其存在18，612種可變剪切形式，利用MinION測序儀可以檢測到超過7，000種可變剪切形式，而這樣的結果利用NGS的短序列測序是不能夠獲得的。

　　6、生物信息學配套軟件的發展近些年來，隨著生物信息分析方法的發展，MinION測序reads成功比對參考基因組的比例已經從66％提升至92％。文章下面對各種工具的適用場景進行了分別介紹。

　　1、堿基識別工具Metrichor是ONT公司推出的基于隱馬爾可夫模型進行堿基識別的軟件。它的使用需要網絡連接。MinION注冊用戶需要獲得開發者賬號才能獲得軟件的源代碼。2016年初，兩個實驗室分別開發了Nanocall和DeepNano軟件。這兩個軟件都可以在本地運行，不需要網絡連接。Nanocall基于隱馬爾可夫模型，可對1D read在本地進行堿基識別；DeepNano基于recurrent neural network framework，可以獲得比隱馬爾可夫模型更準確的堿基識別。

　　2、序列比對工具傳統的NGS序列比對軟件不能滿足MinION序列比對的需求。這是因為MinION測序數據錯誤率相對高且序列長，即使調整參數也不能取得好的效果。在這種情況下，適合MinION測序數據的比對軟件應運而生。

　　MarginAlign是通過更好地估計MinION測序reads測序錯誤來源從而提高與參考基因組的比對效率。通過評估檢測到的變異，發現其顯著提高了比對的準確性。由于MarginAlign是基于LAST或BWA mem的比對結果進行優化，結果的最終準確性依賴最初的比對結果。GraphMap是另一個用于MinION測序數據比對的軟件。它利用的是一種啟發式（heuristics）方法，對高錯誤率reads和長reads進行了優化。一項研究表明GraphMap比對的靈敏性可與BLAST媲美，且它對reads測序錯誤率的估計與MarginAlign相當。

　　3、從頭組裝工具MinION測序數據不適合利用NGS數據組裝的de Bruijn圖法進行組裝，主要存在兩方面的原因。

　　一是de Bruijn圖法等方法依賴測序reads拆分的k－mer測序準確，而高錯誤率的MinION測序reads不能保證這一點；

　　二是de Bruijn圖的結構不適用長reads。MinION測序數據的長reads更適合Sanger測序時期基于有overlap的共有（consensus）序列組裝的方法。需要的是在組裝前進行測序reads的糾錯。第一個基于這種原理進行組裝的研究組利用MinION數據組裝了一個完整的E． coli K－12 MG1655基因組，序列準確率達到99．5％。他們利用的流程稱為nanocorrect，首先利用graph－ based，greedy partial order aligner方法進行糾錯，然后利用Celera Assembler將糾錯后的reads進行組裝，最后利用nanopolish對組裝結果進行進一步提升。

　　4、單核苷酸變異檢測工具Reference allele bias是一種在變異檢測中傾向于少檢測出變異的現象。該現象在測序reads錯誤率高的情況下尤為嚴重。MarginAlign中的marginCaller模塊是研究機構開發的適用于MinION測序數據的變異檢測軟件。MarginCaller利用maximum－likelihood參數估計和多條測序reads序列比對來檢測單核苷酸變異。當計算機模擬出測序錯誤為1％時，測序深度在60X，marginCaller檢測出的SNV具有97％的準確率和完整度。另外一項研究中，研究者利用GraphMap方法，檢測人基因組的雜合變異，可以達到96％的準確率。利用計算機模擬的數據，GraphMap同樣可以高準確率，高完整度地檢測出結構變異。Nanopolish也可以用來檢測變異。它用的是event－level alignment算法。

　　在該方法中，從參考基因組序列開始，依次評估參考基因組序列產生的電信號與測序reads的相似性進而依次修飾參考基因組序列，生成一個consensus read。直到consensus read與測序read產生的電信號足夠相似，將consensus read與參考基因組序列比較，得到變異。該方法在埃博拉病毒的研究中有大約80％的準確性。PoreSeq采用與Nanopolish類似的算法。它可以利用更低深度的測序數據獲得高準確率和高完整度的SNV檢測。在一項研究中，PoreSeq在16X測序深度下獲得99％準確率和完整度的SNV檢測，與marginAlign相比，它顯著降低了測序深度。

　　5、共有序列的測序（consensus sequencing）方法MinION測序數據目前只有92％的準確性。在低深度測序的情況下，不能夠滿足類似單體型（haplotype phasing）和人樣品的SNV檢測的要求。文章提到的解決問題的方法是rolling circle amplication，它的原理是將一個片段進行多次擴增，在一個DNA分子上生成多個拷貝，這樣最終獲得的共有序列測序結果的準確率可以達到97％。

 

　　三、MinION目前的應用領域

　　1、即時檢測傳染源NGS測序方法可以在醫院環境下進行傳染源等病菌的檢測，而MinION測序方法提供的是一種全新的體驗。MinION在測序讀長，攜帶的方便性，檢測時長方面具有NGS不可比的優勢。文獻記載從樣品準備到發現致病菌只需要6小時時間，而從樣品放置機器到發現致病菌只需要4分鐘。文章列舉了截至目前用MinION測序儀涉及研究的物種及詳細描述了西非爆發埃博拉病毒時，MinION測序方法在病毒檢測過程中起到的重要作用。

　　2、非整倍體檢測MinION可以在胎兒非整倍體產前檢測中發揮重要作用。利用NGS平臺，通常需要1－3周時間獲得結果。而利用MinION測序方法，文獻報道只需要4小時。

　　3、太空應用在太空飛行中，發掘細菌和病毒是很困難的事情。大部分研究是將樣品帶回地球進行測序鑒定。目前，NASA準備利用MinION測序儀在國際空間站進行病菌的實時測序。

 

　　四、展望

　　1、PromethION為了滿足研究人員對高通量測序的需求，ONT公司開發了一個臺式納米孔測序儀—PromethION。PromethION有48個flow cell，可以單獨運行也可以并行。每個flow cell包括3，000個通道（channel），每天產生6Tb測序數據。

　　2、測序read準確性目前MinION測序儀的測序準確率在92％左右。對于類似致病菌和可變剪切的發掘，這樣的測序準確率可以滿足需求。但是對于臨床檢測，通常read準確率需要達到99．99％。因此，文章提到ONT公司需要在測序相關的化學反應和堿基識別軟件方面進行優化。另外，文章提到MinION測序方法存在非隨機的測序錯誤。比如MinION不能很好處理長于6個核苷酸的同聚物的測序，同時缺少堿基修飾檢測的內參訓練。如果這兩個問題能夠得到解決，共有序列（consensus）測序的準確率可以達到大于99．99％。

　　3、測序read長度目前MinION測序長度達到150kb。在未來一段時間，可以期許其測序長度可以得到更大提升。

　　4、RNA直接測序逆轉錄和PCR擴增會導致很多RNA自身信息的丟失，所以目前ONT公司和一些研究機構正在嘗試用納米孔技術進行RNA直接測序。之前的研究已經為此奠定了基礎，比如研究表明可以對tRNA進行單通道和固態納米孔（solid－state nanopore）檢測，且納米孔可以檢測DNA和tRNA的堿基修飾。

　　5、單分子蛋白測序目前，質譜（mass spectrometry）是做蛋白組分析較好的技術，但是對于靈敏性，準確性和分辨率，目前的技術都存在局限性。2013年一項研究報道了酶介導的蛋白通過單通道納米孔。這項研究表明蛋白的序列特征可以被檢測。這些發現為蛋白質納米孔測序奠定了很好的基礎。